A vitrificação não foi uma única invenção. Foi o resultado de uma sequência de problemas diferentes resolvidos pelos investigadores em células, embriões, órgãos e, mais tarde, na biostase humana.
O objectivo parece simples: arrefecer tecido rico em água até formar um vidro, sem que se forme gelo destrutivo.
A execução não é simples. Os crioprotectores podem ser tóxicos. A sua introdução pode distorcer as células. Os objectos de grande dimensão arrefecem de forma desigual, acumulam tensões mecânicas e são muito mais difíceis de reaquecer.
Os procedimentos modernos são, por isso, sistemas, não receitas. A sua qualidade depende da química, da perfusão, da temperatura, do tempo, da geometria e da medição a funcionarem em conjunto.
Antes da vitrificação: o frio criava uma segunda lesão
A criopreservação inicial significava, sobretudo, congelação. O arrefecimento retardava as reacções químicas, mas a água cristalizava em gelo.
O gelo expulsa sais e outros solutos para o líquido remanescente. As células podem por isso sofrer simultaneamente deslocamento mecânico, concentrações extremas de solutos, desidratação e lesão das membranas.
Arrefecer mais rapidamente pode tornar os cristais mais pequenos, mas a água comum exige velocidades extraordinárias para se transformar em vidro sem ajuda química. Isso só funciona em amostras extremamente finas.
O problema histórico não era apenas atingir uma temperatura baixa. Era atingi-la sem permitir que a água se reorganizasse em cristais destrutivos.
1937 a 1938: as primeiras experiências de vitrificação cinética
Basile Luyet propôs a vitrificação como estratégia de preservação biológica em 1937.
Em 1938, Luyet e Eugene Hodapp relataram a recuperação da motilidade em espermatozoides de rã expostos a ar líquido após desidratação com sacarose concentrada.
A experiência original dependeu de películas microscópicas e de uma velocidade de arrefecimento extrema. Demonstrou uma possibilidade física, não um protocolo de órgãos passível de ampliação.
Esta abordagem é hoje designada vitrificação cinética: evita a cristalização ao retirar calor mais depressa do que o gelo consegue formar núcleos e crescer.
Esta abordagem deixa de ser viável quando se aumenta a escala. A área de superfície cresce mais lentamente do que o volume, pelo que o centro de uma amostra grande não consegue acompanhar a superfície com rapidez suficiente.
1949: o glicerol muda o problema
Christopher Polge, Audrey Smith e Alan Parkes descobriram em 1949 que o glicerol podia proteger espermatozoides durante a preservação a baixa temperatura.
O seu artigo na Nature estabeleceu a importância prática dos agentes crioprotectores penetrantes.
Estas moléculas entram nas células, ligam-se à água e reduzem a quantidade de gelo formado a uma dada temperatura. Reduzem também a concentração de solutos que, de outro modo, seria destrutiva durante a congelação.
A descoberta transformou a criobiologia porque a velocidade de arrefecimento deixou de ser a única variável de controlo. A composição química passou a poder alterar o comportamento de fase da água.
Introduziu também um novo problema de optimização. Mais crioprotector suprime o gelo com mais eficácia, mas aumenta a lesão química e osmótica.
1959 a 1968: mais agentes e introdução por etapas
Em 1959, James Lovelock e Marcus Bishop relataram que o dimetilsulfóxido protegia vários tipos de células da lesão por congelação.
O DMSO atravessava algumas membranas mais facilmente do que o glicerol. Ampliou o leque de células que podiam ser crioprotegidas e continua a ser amplamente utilizado na criopreservação de laboratório e clínica.
John Farrant explorou depois o aumento da concentração de crioprotector com a redução simultânea da temperatura, mantendo o tecido num líquido concentrado sem formar gelo deliberadamente.
Isto antecipava uma característica central dos protocolos modernos: introduzir o crioprotector por etapas, a baixa temperatura, em vez de expor tecido quente à concentração total de uma só vez.
A introdução por etapas limita o choque osmótico. A temperatura mais baixa reduz muitas velocidades de reacção química e pode tornar mais tolerável uma exposição que de outro modo seria lesiva.
Em 1968, experiências mostraram que os glóbulos vermelhos podiam atingir a temperatura do azoto líquido sem gelo visível, com concentração suficientemente elevada de glicerol.
Os elementos conceptuais essenciais já estavam definidos. O que faltava era uma forma prática de os aplicar a tecido complexo e vascularizado.
1984: a vitrificação torna-se uma estratégia para órgãos
O artigo de 1984, “Vitrification as an Approach to Cryopreservation”, apresentou a vitrificação como uma abordagem viável para a conservação de órgãos.
A estratégia chamava-se por vezes vitrificação de equilíbrio. Em vez de exigir uma velocidade de arrefecimento impraticável, utilizava-se crioprotector em quantidade suficiente para reduzir a velocidade crítica de arrefecimento a valores alcançáveis em sistemas maiores.
Essa mudança expôs três limitações interligadas:
- A solução tem de resistir ao gelo a velocidades de arrefecimento e reaquecimento alcançáveis.
- O órgão tem de tolerar a introdução e a remoção dessa solução.
- O crioprotector tem de alcançar todas as regiões antes de o arrefecimento começar.
Uma formulação podia funcionar na perfeição num tubo de ensaio e falhar num órgão, porque a resistência vascular, a distância de difusão ou a toxicidade alteravam o resultado.
1985: embriões vivos regressam de um estado vítreo
William Rall e Gregory Fahy relataram a criopreservação sem gelo de embriões de rato a -196 °C, em 1985.
Foi uma demonstração biológica decisiva. Células mamíferas nucleadas e vivas conseguiram sobreviver ao arrefecimento e ao reaquecimento através de um estado totalmente vitrificado.
Os embriões continuam a ser estruturas muito pequenas. A temperatura e a concentração de crioprotector nos embriões podem mudar rapidamente e de forma uniforme, ao contrário do que acontece num órgão adulto.
O resultado validou o método, tornando ao mesmo tempo o problema da escala mais visível.
O problema da escala divide-se em quatro problemas
1. Toxicidade do crioprotector
A concentração necessária para a vitrificação pode perturbar proteínas, membranas e o metabolismo celular. A toxicidade depende do agente, da concentração, da temperatura, do tempo de exposição e do tipo de tecido.
Isto significa que “menos tóxico” não é uma propriedade de uma única molécula. É uma propriedade de todo o protocolo de introdução e remoção.
2. Tensão osmótica
A introdução de solução concentrada retira água das células. A sua remoção pode fazer a água regressar demasiado rapidamente.
Os protocolos modernos usam aumentos graduais da concentração, soluções de suporte, controlo da temperatura e solutos não penetrantes para manter as variações de volume dentro de limites toleráveis.
3. Distribuição desigual
Um órgão não é um recipiente com líquido uniforme. O crioprotector percorre vasos, atravessa paredes capilares e difunde-se pelo tecido.
Coágulos, edema, doença vascular, isquemia e a barreira hematoencefálica podem deixar algumas regiões abaixo da concentração necessária para suprimir o gelo.
É por isso que a perfusão moderna mede pressão, fluxo, temperatura e concentração venosa, em vez de depender apenas do volume de solução.
4. Gradientes térmicos
Um objecto de grande dimensão arrefece de fora para dentro. Temperaturas diferentes provocam velocidades de contracção diferentes.
Perto da transição vítrea e abaixo dela, o material não consegue relaxar as tensões com rapidez. Se a tensão exceder a resistência mecânica, podem formar-se fracturas.
A solução foi o arrefecimento a velocidade controlada, o recozimento junto à temperatura de transição vítrea (Tg) e uma descida mais lenta pela região vítrea. Estes princípios moldam hoje o arrefecimento humano controlado por computador.
Décadas de 1990 e 2000: as misturas substituem o pensamento centrado num único agente
Nenhum crioprotector isolado optimizava todos os requisitos. Os investigadores passaram a combinar cada vez mais agentes penetrantes, para que cada um contribuísse sem atingir a sua concentração individual mais lesiva.
As soluções veiculares controlavam iões, pH e condições osmóticas. Os polímeros não penetrantes influenciavam a água presente nos tecidos e a resposta dos vasos sanguíneos.
Bloqueadores sintéticos de gelo actuavam sobre a nucleação e o crescimento heterogéneos do gelo. Reduziram a dependência de concentrações muito elevadas de crioprotector.
Soluções como a VS55 e, mais tarde, a M22 ilustraram uma abordagem de engenharia de sistemas: combinavam vários agentes, inibidores de gelo e uma solução de suporte cuidadosamente concebida, com protocolos definidos de perfusão e controlo térmico.
Uma revisão de 2004 sobre vitrificação de órgãos descreve avanços na redução da toxicidade, na lesão pelo frio, no controlo da nucleação e na perfusão de órgãos.
O principal avanço não consistiu em eliminar a toxicidade. Os investigadores aprenderam a distribuir a carga entre a química, o tempo e a temperatura.
Experiências com rins de coelho: importantes e fáceis de sobrevalorizar
O trabalho com rins de coelho demonstrou que um órgão mamífero vascularizado podia ser carregado com uma solução de vitrificação complexa, arrefecido até um estado vítreo, reaquecido e transplantado.
Num dos casos descritos, o rim transplantado funcionou como único rim de um coelho durante um período prolongado.
Esse resultado é relevante porque passou de amostras microscópicas para a função de um órgão inteiro. Não estabeleceu um procedimento clínico fiável.
A literatura posterior assinala que o sucesso do transplante a longo prazo não foi alcançado de forma reprodutível. A distribuição, a toxicidade e o reaquecimento convencional pela superfície continuaram a ser factores limitantes.
Esta é a interpretação correcta da evidência: uma prova de conceito relevante, mas com limitações de reprodutibilidade e de escala.
2015: a qualidade da preservação torna-se visível à escala sináptica
A criopreservação estabilizada por aldeído combinou fixação química, perfusão com crioprotector e vitrificação em cérebros de coelho e de porco.
O estudo de 2015 relatou membranas, sinapses, vesículas, mielina e estruturas intracelulares nítidas após o reaquecimento e a preparação para microscopia electrónica.
Demonstrou que a ultraestrutura neural podia manter-se muito bem preservada após um ciclo de armazenamento sem gelo em cérebros de grande dimensão.
Não demonstrou recuperação viável. A fixação por aldeído cria deliberadamente ligações cruzadas nas moléculas biológicas e é incompatível com a recuperação normal da função biológica.
A experiência respondeu, por isso, a uma questão estrutural, não à questão completa da reanimação.
O seu contributo metodológico mais importante foi outro: a preservação deve ser avaliada pela inspecção das estruturas de interesse, não apenas pela observação de que uma amostra parece vítrea.
2023: o nanoaquecimento resolve o reaquecimento em rins de rato
O arrefecimento é apenas metade da criopreservação reversível. O reaquecimento é, muitas vezes, mais difícil.
Se o reaquecimento for demasiado lento, o gelo pode crescer durante a desvitrificação. Se o calor chegar sobretudo pela superfície, os gradientes térmicos podem fracturar o órgão.
O nanoaquecimento pode resolver ambos os problemas, distribuindo nanopartículas de óxido de ferro pela vasculatura e aquecendo-as com um campo magnético alternado de radiofrequência.
Em 2023, investigadores vitrificaram rins de rato, armazenaram-nos até 100 dias, nanoaqueceram-nos e transplantaram-nos.
Durante o período de seguimento relatado, os rins recuperados restabeleceram uma função renal suficiente para manter vivos receptores sem rins nativos.
O resultado dependeu de mais do que o reaquecimento. A equipa adoptou uma formulação menos tóxica e modelizou a introdução do crioprotector para melhorar a sua concentração no tecido.
A história da vitrificação mostra repetidamente que resolver um obstáculo põe em evidência o seguinte e que uma recuperação bem-sucedida exige que todas as etapas funcionem em conjunto.
2024 a 2026: sistemas físicos de maior dimensão e tecido neural funcional
Em 2024, investigadores relataram vitrificação física à escala de um órgão humano em sistemas de 0,5 a 3 litros.
Combinaram termometria interna, recozimento, arrefecimento controlado e inspecção por micro-TC. Demonstraram também nanoaquecimento em volumes até 2 litros.
As demonstrações realizadas em volumes maiores foram sobretudo demonstrações físicas. Evitar gelo visível e fracturas é necessário, mas não estabelece a recuperação biológica de um órgão à escala humana.
Em 2026, um estudo na PNAS relatou recuperação funcional a curto prazo de tecido hipocampal de rato adulto após vitrificação e reaquecimento.
O estudo mediu morfologia, capacidade de resposta mitocondrial, excitabilidade neuronal, transmissão sináptica e potenciação de longa duração.
O estudo envolveu cortes de cérebro de rato e preparações de cérebro inteiro com uma taxa de sucesso baixa, não cérebros humanos. O seu alcance é mais restrito, mas continua a ser substancial.
Mostrou que o tecido neural de mamíferos adultos pode recuperar funções electrofisiológicas depois de a mobilidade molecular ter sido interrompida num estado vítreo.
A biostase humana herda a ciência em condições mais difíceis
As experiências de armazenamento de órgãos começam com tecido saudável, tempos controlados e acesso planeado à vasculatura.
A biostase humana começa após a declaração legal de morte. Doença, isquemia quente, coagulação, edema, transporte e doença vascular podem todos comprometer a administração do crioprotector.
O objectivo imediato é a preservação estrutural para uma eventual reparação futura, não um transplante reversível no presente.
Esta diferença explica por que motivo as afirmações de laboratório não podem ser transpostas directamente para afirmações sobre pacientes.
Como a Tomorrow.bio adaptou a vitrificação a condições de campo
A Tomorrow.bio transferiu a perfusão crioprotectora de corpo inteiro para ambulâncias especializadas. O procedimento pode começar junto do paciente, em vez de esperar pelo transporte até à Suíça.
Isto altera um factor importante que a química não consegue corrigir: o tempo de isquemia antes da perfusão.
O protocolo actual utiliza uma solução baseada em VM-1, adaptada à crioprotecção no local e ao transporte subsequente em gelo seco.
Um programa de investigação da EBF testou a VM-1 em condições pós-morte simuladas, incluindo três horas de isquemia quente.
O programa mediu o índice de refracção do efluente venoso, o tempo de perfusão, a variação de peso, a retracção cerebral e a formação de gelo, enquanto testava alterações no perfusato e no procedimento.
Esta é a principal questão prática nos casos humanos: não saber se uma solução ideal permite vitrificar, mas determinar até que ponto um paciente real com lesão isquémica pode ser adequadamente perfundido.
A medição passou a fazer parte do procedimento
A investigação inicial sobre vitrificação estabelecia muitas vezes o sucesso através de transparência, calorimetria, difracção de raios X, sobrevivência ou função após o reaquecimento.
A biostase humana não pode usar a recuperação como resultado final no presente. Precisa, por isso, de medidas de preservação não destrutivas e por amostragem.
A Tomorrow.bio realiza uma tomografia computorizada a cada paciente, à temperatura do azoto líquido, para estimar a distribuição do crioprotector e identificar gelo ou defeitos macroscópicos em condições padronizadas.
Mediante consentimento específico, microamostras de tecido neural podem ser usadas para avaliar, por microscopia electrónica, membranas, sinapses e a ultraestrutura local.
Estes métodos e as suas limitações estão descritos em procedimentos de verificação da qualidade na biostase.
A medição altera o próprio desenvolvimento. Quando uma falha se torna visível e comparável entre casos, é possível orientar directamente para ela alterações na química e no protocolo.
O que melhorou e o que continua sem solução
A vitrificação moderna alcançou várias coisas que a congelação inicial não conseguia:
- Preservação sem gelo de muitas células, embriões e pequenos tecidos.
- Recuperação funcional de órgãos animais vitrificados em condições experimentais bem definidas.
- Preservação estrutural à escala sináptica em cérebros mamíferos fixados.
- Arrefecimento e recozimento controlados por computador em sistemas de maiores dimensões.
- Reaquecimento volumétrico através de tecnologias como o nanoaquecimento.
- Métodos de tomografia computorizada e microscopia electrónica para medir resultados reais de preservação.
Não produziu, ainda, criopreservação reversível de corpo inteiro em seres humanos.
Os problemas que restam incluem a isquemia pós-morte, a perfusão desigual, a toxicidade do crioprotector, os efeitos da barreira hematoencefálica, os gradientes térmicos de corpo inteiro, a prevenção de fracturas e o reaquecimento uniforme e seguro.
Mesmo uma preservação estrutural bem-sucedida não resolveria os futuros problemas de reparação, reanimação e tratamento da causa original da morte.
Essas distinções são desenvolvidas em desafios técnicos para a criopreservação reversível.
TL;DR: A vitrificação melhorou através de melhores crioprotectores, perfusão, controlo do gelo, arrefecimento, reaquecimento e medição estrutural. Alguns problemas estão resolvidos a pequena escala, mas a reversibilidade num ser humano completo continua sem solução.
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