Depois da perfusão crioprotetora, o paciente não é simplesmente colocado em azoto líquido.
O paciente segue um programa de temperatura controlado por computador que dura vários dias. Sensores colocados no interior do paciente permitem verificar se as diferentes regiões anatómicas arrefecem de forma uniforme ou se surgem gradientes térmicos perigosos.
O problema de engenharia muda ao longo da descida. O arrefecimento inicial deve limitar a formação de gelo. Perto da transição vítrea e abaixo dela, a precisão e a uniformidade térmica tornam-se mais importantes do que a velocidade.
Porque é necessário um arrefecimento controlado
Os agentes crioprotetores reduzem a taxa de arrefecimento necessária para evitar a formação de gelo. Permitem que os tecidos ricos em água atinjam um estado altamente viscoso, semelhante ao vidro, em vez de formarem cristais de gelo em grande escala.
A temperatura de transição vítrea relevante, designada Tg, depende da solução, da sua concentração e do método de medição. É um intervalo, não um limiar biológico universal.
Nas soluções relevantes para a criopreservação humana, esta região situa-se habitualmente entre -120°C e -135°C.
Acima dessa região, um arrefecimento demasiado lento pode permitir a nucleação e o crescimento de gelo. Abaixo dela, o material comporta-se cada vez mais como um sólido frágil.
Se a superfície arrefecer muito mais depressa do que o centro, as diferentes regiões contraem-se de forma desigual. A tensão termomecânica resultante pode provocar fissuras.
Isto impõe um equilíbrio delicado: arrefecer com rapidez suficiente antes da vitrificação e, depois, controlar os gradientes e a taxa de arrefecimento à medida que os tecidos entram no estado vítreo.
Consulte a explicação sobre a diferença entre congelação e vitrificação para compreender os fenómenos de mudança de fase envolvidos.
A caixa de arrefecimento de primeira geração
O sistema de primeira geração da Tomorrow.bio, designado caixa de arrefecimento V1, estabeleceu a arquitetura básica para o arrefecimento controlado de todo o corpo.
O paciente é colocado numa câmara isolada concebida especificamente para esse efeito. Um computador controla o ambiente criogénico da câmara enquanto termopares medem temperaturas em vários pontos.
O controlador segue uma curva programada, em vez de manter continuamente a capacidade máxima de arrefecimento. Cada canal de sensor é registado como parte do histórico térmico do paciente.
Isto já é fundamentalmente diferente da imersão direta. A máquina pode abrandar, manter ou alterar as condições da câmara em resposta ao que está realmente a acontecer ao paciente.
O sistema de segunda geração baseado em recipiente Dewar
O sistema de segunda geração da Tomorrow.bio realiza o arrefecimento controlado num recipiente Dewar concebido para esse fim.
O paciente permanece dentro do recipiente enquanto uma tampa especializada integra o equipamento de arrefecimento, os controlos por computador, as válvulas, as ligações dos sensores e as passagens dos termopares.
Os termopares são colocados em vários pontos no interior do paciente. Sensores adicionais monitorizam o ambiente térmico dentro do recipiente.
Por isso, o sistema monitoriza mais do que a temperatura de referência definida. Monitoriza também a rapidez com que as diferentes regiões do paciente arrefecem.
O computador ajusta a temperatura no recipiente Dewar e a taxa de arrefecimento para manter essas leituras dentro dos limites definidos pelo protocolo.
Um corpo de grandes dimensões não pode ser perfeitamente isotérmico durante o arrefecimento. O objetivo prático é minimizar a dispersão e impedir que qualquer região medida se adiante ou atrase de forma perigosa em relação às outras.
A geometria do recipiente Dewar reduz ainda a manipulação entre o arrefecimento controlado e o armazenamento criogénico. A mesma estrutura fechada pode proporcionar um ambiente térmico estável e simétrico em torno do paciente.
A temperatura de referência não é a temperatura do paciente
Um controlador consegue tornar o ambiente frio rapidamente. Não consegue fazer com que o centro de um corpo humano acompanhe essa temperatura de forma instantânea.
O calor dos tecidos mais profundos tem de ser transferido até à superfície. A geometria, a composição corporal, a distribuição do crioprotetor e a posição dos sensores influenciam o desvio observado.
É por isso que um único sensor na câmara não basta. Um ambiente nominal de -130°C não prova que todas as partes medidas do paciente atingiram os -130°C.
O sistema de controlo tem de considerar tanto a temperatura absoluta como a diferença entre canais. O ponto que arrefece mais lentamente, o que arrefece mais depressa e a dispersão global fornecem informações relevantes.
A calibração, a colocação e a continuidade dos termopares também importam. Leituras implausíveis ou falhas dos sensores devem ser assinaladas, e não incorporadas sem aviso na curva por meio de médias.
O programa de temperatura em três fases da Tomorrow.bio
O protocolo atual tem três fases distintas. Os valores são metas operacionais para este equipamento e para este protocolo de crioproteção, não constantes universais aplicáveis a todos os sistemas de vitrificação.
1. Descer rapidamente até -130°C
Na primeira fase, o paciente passa da temperatura do gelo seco para aproximadamente -130°C, à maior velocidade compatível com a segurança e com a dispersão de temperatura medida.
A velocidade é importante nesta fase porque as regiões insuficientemente protegidas ainda podem formar gelo antes de o tecido se tornar vítreo.
O computador não segue apenas o tempo decorrido. Monitoriza os termopares e ajusta o ambiente de arrefecimento em torno do paciente.
2. Permitir um retorno controlado até -120°C
Depois de se atingir aproximadamente -130°C, reduz-se o arrefecimento ativo e deixa-se o paciente aquecer naturalmente até aproximadamente -120°C.
Trata-se de uma fase de recozimento. Perto da Tg, o material crioprotegido mantém mobilidade molecular suficiente para que parte da tensão mecânica acumulada se dissipe.
Este aquecimento controlado permite ainda que as regiões mais quentes e mais frias se aproximem termicamente antes de o material entrar num estado vítreo mais rígido.
O recozimento não reverte danos biológicos preexistentes. O seu propósito é mais restrito: reduzir os gradientes térmicos e as tensões criadas pela contração desigual.
3. Descer até -196°C a cerca de 1°C por hora
A partir de cerca de -120°C, a descida prevista é de aproximadamente 1°C por hora até o paciente atingir a temperatura do azoto líquido.
Esse intervalo final de 76 graus demora cerca de três dias, mesmo sem contar pausas e ajustes de controlo.
Manter 1°C por hora num corpo de grandes dimensões e termicamente heterogéneo é um problema de controlo, não apenas uma questão de temporizador.
O controlador tem de ajustar continuamente o ambiente do recipiente Dewar para que os termopares internos desçam em conjunto sem criar gradientes excessivos.
Quando uma região fica atrás, forçar o ambiente a arrefecer mais pode arrefecer em excesso outra região. A precisão consiste em equilibrar todo o campo de sensores, não em perseguir uma única leitura.
Porque é a fase de recozimento cientificamente plausível
A investigação sobre vitrificação em grande escala identifica duas zonas de risco opostas: arrefecimento insuficiente acima da Tg e tensão mecânica excessiva perto e abaixo da Tg.
Um estudo de 2024 sobre vitrificação à escala de órgãos humanos utilizou várias sondas internas e concluiu que o recozimento reduz os gradientes antes de o material entrar na fase vítrea.
O mesmo estudo verificou que um arrefecimento lento abaixo da região de recozimento ajuda a evitar a formação de novo de grandes gradientes e tensões.
Uma investigação termomecânica distinta concluiu que o recozimento perto da Tg altera substancialmente a tensão residual e reduz a sua dependência da taxa de arrefecimento anterior.
Estes estudos sustentam a estratégia de controlo subjacente. Não validam de forma independente cada valor exato de referência no protocolo de corpo inteiro da Tomorrow.bio.
Corpos humanos completos são maiores e mais heterogéneos do que soluções ou órgãos de laboratório. Continuam a ser necessários registos diretos de temperatura e exames de imagem realizados após o arrefecimento.
O que o computador regista
O dado relevante não é uma simples mensagem de “arrefecimento concluído”. É a série temporal completa de todos os canais de temperatura.
O registo deve indicar as taxas de arrefecimento, as pausas, os períodos de aquecimento controlado, os gradientes entre sensores, as ações do controlador, os alarmes e quaisquer desvios da curva planeada.
Esses dados passam a fazer parte da avaliação da qualidade da criopreservação.
Após o arrefecimento, uma tomografia computorizada realizada à temperatura do azoto líquido pode avaliar a distribuição do crioprotetor, a presença de gelo, deformações evidentes e fraturas que os dados de temperatura, por si só, não revelam.
Porque se termina à temperatura do azoto líquido
À pressão atmosférica normal, o azoto entra em ebulição perto dos 77,34 kelvin, aproximadamente -195,8°C, de acordo com o NIST Chemistry WebBook.
O armazenamento em azoto líquido é passivo. Enquanto houver líquido suficiente no recipiente, o seu equilíbrio de ebulição mantém um ambiente criogénico estável sem refrigeração mecânica.
A descida controlada só termina quando o paciente está termicamente pronto para esse estado estável. O armazenamento não substitui o arrefecimento.
A conceção e as limitações da fase seguinte são abordadas nos artigos sobre recipientes Dewar criogénicos modernos e armazenamento a temperatura intermédia.
Resumo: A Tomorrow.bio recorre a arrefecimento controlado por computador e a sensores internos de temperatura. O processo arrefece rapidamente até próximo da transição vítrea, alivia as tensões térmicas e desce depois lentamente até -196°C.
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